Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 实验方案 1

多克隆疟原虫株系中特定单倍型药物反应表型的剖析：

1. 实验材料和试剂准备

- 选择3个疑似多克隆的P. falciparum株系，例如：IPC_3445 (MRA-1236), IPC_5202 (MRA-1240), IPC_6403 (MRA-1285)。

- 准备O+型人类红细胞和RPMI 1640培养基，以及所需的补充剂和抗生素。

- 准备氯喹、甲氟喹和哌拉喹药物储备溶液。

- 准备用于DNA提取、基因分型和PCR反应的相关试剂。

2. 疟原虫株系的体外培养

- 使用标准体外培养条件，将疟原虫株系在37°C、5% CO2和90% N2气氛下培养。

3. 多克隆性质的确认

- 提取每个疟原虫株系的DNA，并在24个高度多态性SNP位点进行基因分型。

4. 单一寄生虫谱系的分离

- 通过限制稀释法，将疟原虫株系在96孔板中进行稀释，以分离单个受感染的红细胞。

- 使用SYBR® Green I荧光染料检测寄生虫DNA，确定阳性孔。

5. 基因分型和系统发育分析

- 对每个阳性孔中的寄生虫进行基因分型，使用24-SNP分子条形码法。

- 构建系统发育树，分析不同寄生虫谱系之间的关系。

6. 体外抗疟药敏感性测试

- 使用SYBR® Green Antimalarial Assay对氯喹、甲氟喹和哌拉喹的敏感性进行测试。

- 测定每种药物的半最大抑制浓度（IC50）。

7. 寄生虫存活试验

- 对于CQ和PPQ，使用环阶段存活试验(RSA)和哌拉喹存活试验(PSA)来确定寄生虫对药物的存活率。

8. 抗疟药抗性位点的测序和基因分型

8.1 目标基因的选择

选择已知与抗疟药抗性相关的基因，包括但不限于：

- 氯喹抗性相关基因：pfcrt（疟原虫氯喹抗性转运蛋白）

- 甲氟喹和哌拉喹抗性相关基因：pfmdr-1（疟原虫多药耐药1基因）

- 蒿甲醚抗性相关基因：K13基因

8.2 DNA提取和PCR扩增

- 使用DNA提取试剂盒从疟原虫培养物中提取基因组DNA。

- 设计特异性引物，针对上述基因进行PCR扩增。例如，使用五组引物覆盖整个pfcrt基因。

8.3 SNPs检测

- 使用Sanger测序技术对PCR产物进行测序，以检测pfcrt、pfmdr-1和K13基因中的单核苷酸多态性（SNPs）。

- 利用测序结果分析软件（如DNASTAR Lasergene）进行序列数据的分析和可视化。

8.4 拷贝数变异检测

- 使用ΔΔCT方法确定pfmdr-1和pfmp-2（疟原虫血浆膜蛋白2基因）的拷贝数，这些基因与甲氟喹和哌拉喹抗性相关。

- 通过实时定量PCR（qPCR）技术，在同一孔中同时扩增目标基因和内参基因（如β-微管蛋白基因或丝氨酸tRNA连接酶基因）。

8.5 qPCR实验操作

- 准备主混合液，包含Multiplex Probe qPCR Mix Plus U （GDSBio, P2701）、无菌水、目标基因和内参基因的预配方Taqman SNP检测。

- 将主混合液分配到96孔PCR板中，每个样本包含75 ng的寄生虫DNA。

- 使用CFX96实时PCR仪器进行样品扩增，并使用基因表达模块分析结果。

8.6 数据分析

- 将目标基因的拷贝数与内参基因的拷贝数进行比较，以确定相对拷贝数。

- 使用已知拷贝数的标准样品（如3D7株系）进行校准。

- 对于pfmdr-1和pfmp-2基因，分析是否存在基因扩增现象，这可能与抗药性发展有关。

8.7 结果记录和解释

- 记录所有测序和qPCR结果，包括基因型和拷贝数。

- 解释测序和拷贝数变异数据，分析它们与体外抗药性表型之间的潜在联系。

8.8 质量控制

- 包括使用已知基因型的实验室控制株系作为阳性和阴性对照。

- 对每个实验步骤进行重复，以确保数据的准确性和可重复性。

以上步骤提供了详细的实验流程，用于检测和分析与抗疟药抗性相关的基因变异。实验操作应严格遵守实验室规程和生物安全指南，确保数据的准确性和可靠性。

9. 数据分析

- 使用GraphPad Prism软件分析IC50值和存活率数据。

- 应用统计方法比较不同寄生虫谱系之间的差异。

10. 结果解释和报告

- 解释实验结果，讨论不同寄生虫谱系的抗药性表型。

- 撰写实验报告，包括实验方法、结果和讨论。

11. 安全性和质量控制

- 确保实验操作符合生物安全标准。

- 使用已知的实验室控制株系作为阳性和阴性对照。

12. 实验材料的保存和记录

- 记录所有实验步骤和结果。

- 保存所有原始数据和实验材料，以备后续分析和验证。

这个实验方案提供了一个全面的框架，用于研究P. falciparum株系的多克隆性和抗药性表型。实验操作应严格遵守实验室规程和生物安全指南。

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 

货号：P2701，P2702，P2703，P2704 

产品简介 

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 是用于探针法实时定量 PCR 的 2×浓缩预混液，使用时 只需加入模板、引物和探针即可进行反应。本品含有抗体技术修饰的热启动酶 Hotstart Taq DNA 聚合酶，配合东盛特制的 Real Time PCR Buffer，不仅有效抑制引物二聚体和其他非 特异性扩增，而且能够提高扩增效率，可以进行多重探针 qPCR 反应。该试剂引入 了 dUTP/UDG 防污染系统，可以在 PCR 反应前清除含 dUTP 的 PCR 产物，有效避免因 扩增产物的交叉污染对定量的影响。本品方便用于制备 IVD 分子诊断试剂盒，对靶基因定 量准确、可信度高，重复性好。本品可搭配 TaqMan 等各类荧光探针使用，与常见定量 PCR 仪完美兼容，如 ABI、Roche、Bio-Rad 等。 

产品用途

探针法基因表达分析

多重低拷贝基因检测

产品特点

可进行多重探针法荧光定量PCR

适合常见定量机型

高效热启动技术带来高特异和可重复的扩增

含 dUTP/UDG 防污染系统

稳定性高，适合大规模检测